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小课堂 | 硝酸纤维素膜吸附蛋白常见问题（二）
上一次我们的小课堂为大家介绍了NC膜蛋白吸附的相关问题，今天我们主要以影响蛋白质吸附的因素做具体介绍。
我们先来回顾下影响蛋白质吸附的因素：
1、捕获蛋白自身
2、将捕获蛋白点样于NC膜的系统（仪器设备）
3、捕获蛋白点样时的环境湿度
4、溶解捕获蛋白的工作缓冲液
5、用来固着捕获蛋白的NC膜
影响蛋白质吸附的因素之蛋白
蛋白本身
单克隆抗体作为较均一的蛋白捕获剂，优化与 NC 膜的结合过程较为简单，而多克隆抗体由于含有针对大量不同的抗原决定簇的抗体，不同抗体的最佳结合条件可能稍微不同，从而导致蛋白与膜结合条件的优化过程较为复杂。
IgA、IgM 存在结构或者空间位阻等因素，其与膜结合条件的优化过程较为困难。
其次，分子量越大，蛋白越难结合到固相材料上。
影响蛋白质吸附的因素之设备
目前有两种点样方式，划膜式和非接触点膜式。
非接触式点膜：如果蛋白样品中含有其它杂质，容易造成点膜喷头堵塞，不易维护且配件成本高。
划膜式：因划膜式为软管将抗体划到膜表面，而膜本身的物理性质为软脆，如果操作使用不当，划管会在其表面留下印痕。划痕容易对层析的金标复合物形成阻力，导致假阳性。 所以设备的选择及正确的设备操作方式是至关重要的，还有原材料的问题和生产能力问题也都是不容忽视的，划膜设备的品质决定了产品的质量。
jdb电子平台已积累了多年的快速诊断试剂行业经验，我们根据客户的需求研发出了平台移动式、输送带连续式等诊断试剂包被平台，此类划膜式设备在生产过程中能让溶液准确的、均匀的包被在NC膜、聚酯纤维膜或玻璃纤维膜等材料上，是科研或生产单位理想的设备选择。
影响蛋白质吸附的因素之湿度
环境湿度
点膜时的环境湿度严重影响捕获线的质量，尤其对喷膜系统影响严重。如果空气湿度太低，则 NC 膜上聚集静电荷，从而导致蛋白质喷涂于 NC膜表面时容易产生斑点，膜表面容易产生疏水斑。如果空气湿度太高，导致 NC 膜对捕获蛋白的毛细作用加强，从而容易引起捕获线变宽或者扩散。通常情况下，最佳的点膜环境相对湿度应保持在 45-65%。为了确保原材料的均一性，点膜前应根据相应试验确定的最佳平衡时间将 NC 膜在工作环境中平衡。
影响蛋白质吸附的因素之缓冲液
工作缓冲液
由于蛋白质捕获剂千差万别，不同蛋白的最大结合量工作缓冲体系各不相同。影响点膜工作缓冲液的重要因素有两个：
1、蛋白质的可溶性（即用于吸附于 NC 膜的蛋白量）
2、蛋白质分子的稳定性（即倾向于聚集或溶于水）
缓冲液对蛋白质吸附的影响
为了确保足够的蛋白喷涂捕获线，首先必须将捕获蛋白溶解于点膜缓冲液，而点膜缓冲液维持一定的离子浓度可以确保蛋白的可溶性。尽管点膜工作液具备一定的离子强度有助于控制捕获剂的 pH 值，但也可以干扰蛋白质结合的静电相互作用。因此，确定维持足量的捕获蛋白浓度的最低可能离子强度至关重要。
图中采用不同缓冲液以 1mg/ml 鼠 IgG 划线的检测结果
离子强度
在给定的离子强度范围内，蛋白质溶解度随着工作缓冲液中盐浓度的增加按比例增加。为了降低溶液中捕获蛋白分子的稳定性，溶液的离子强度应该尽可能低，这样可以增加蛋白质与 NC 膜结合的速度。同时，也应该注意，高浓度盐能够引起蛋白沉淀，而且喷膜后的干燥过程中大量的盐能够干扰检测试剂的稳定性和灵敏度。
pH值
点膜工作液的 pH 值相当显著的影响蛋白质与 NC 膜的结合效果。通常蛋白质在等电点时的溶解度最低的。因此，为了降低溶液中捕获蛋白分子的稳定性，将捕获蛋白的等电点作为理想的喷膜工作缓冲液的 pH 值。
共沉淀剂
研发人员通常选择添加不稳定剂或共沉淀剂降低溶液中蛋白质的稳定性来调整喷膜工作缓冲液。采用共沉淀剂增加的蛋白质疏水性将提高蛋白质与 NC 膜的结合能力。
最常用的共沉淀剂是醇类，醇类有许多理由值得推荐。醇类的存在有助于NC 膜的重湿润，减少 NC 膜可能带有的静电，而可以降低溶液中的蛋白质稳定性。在基于膜的免疫分析中，3-5%的甲醇可以极大地提高检测性能。
工作缓冲液的构成
缓冲液的构成一般是：PBS（或其他缓冲体系）+ 作用物质（针对某一特定问题）+ pH调整。 配方原则为宜简不宜繁，根据自己的需要添加作用物质，原来的很多需要添加的作用物质，由于膜制造技术的改进已经不再需要。
推荐的缓冲体系为0.01M PBS PH7-7.2，该缓冲体系对多种抗原抗体都有良好的适应性。
作用物质的情况大致罗列如下：
— 少量NaCl，减少信号强度，消假阳。
— 有机醇（甲醇，异丙醇等），润湿膜，减少膜带有的静电，利于结合包被。
— 表面活性剂（Tween-20，TritonX-100等），增加亲水力，可避免线条中空现象，也可增色。
— 糖，保护剂，减缓老化速度，也可以增加亲水力同上。
— 调pH到某个位置，可以消假阳。
膜对蛋白质结合的影响
在快速诊断检测中，NC 膜在三个方面显著影响蛋白质的结合。
1. NC 膜的孔径
2. 膜的后处理
3. 膜的类型
NC膜孔径
在侧向免疫层析中应谨慎的对待 NC 膜供应商提供的 NC 膜标称孔径。膜的实际孔径取决于采用的测量方法，而不同膜生产商采用不同的测量方法，因而两个相同标称孔径的 NC 膜采用相同的测量方法检测其实际孔径差异显著。um指的是膜孔径，而膜的孔径实际上是没有办法界定的。由于干燥成型等过程的非绝对均一，膜的孔径也是非均一的。膜孔径的说法实际上是沿用了一直以来的一个形象称呼。以秒为单位的定义为，纯水层析4cm膜的时间。该单位已经越来越被各大厂商所接受，成为了一个通用的比较标准。以下我们将采用s单位来进行换算。换算情况大致为：8um=135s；6um=180s。
图中采用 Coulter 气孔计检测的 NC 膜孔径数据
膜孔径越小灵敏度越高。但是同时也减慢了跑板速度，增加了非特异性结合的机会，也就是假阳性越高。
NC膜封闭处理
慎用封闭。点膜前封闭的做法是很不可取的。 因为厂家在生产膜时候，各种配方是混合加入原浆的。而点膜前封闭时要将膜浸泡在封闭液内，必然扰乱了膜内正常的物质分布。由此引发了许多问题，也降低了工作效率。也有厂家遇到不封闭就无法包被上膜的问题，其实可以通过其他办法来解决,封闭必然是下策。经常使用的封闭手法有两种。 1、流动封闭，将作用物质处理在样品垫上。 2、膜上定点封闭，将作用物质配成溶液划在膜的特定位置上。只要是将封闭做在了膜上，就必然会对产品的稳定性造成影响。具体的影响程度要通过稳定性测试来评判。
处理后使用疏水膜切片，水的存在会导致捕获线出现抓痕或强烈变异
NC膜的类型
不同制造商生产的相同标称孔径 NC 膜对免疫球蛋白结合水平也不同。免疫蛋白结合最佳的膜对白蛋白结合不一定最佳。因此，相关蛋白结合水平不仅受 NC 膜设计形式的影响，还受到生产商原料来源的影响。
不同厂家的膜差异，这个差异主要来源于两点：
1、生产膜时，使用的聚合物和表面活性剂的来源、类型、数量不同。同理在膜处理中这两类物质一般会对性能产生较大影响。
2、2、处理过程不同。
综上所述，免疫层析试纸条中NC膜的品质影响着整个检测结果。膜的孔径、表活成分浓度等等各种因素都会影响到试纸条的反应时间及特异性和敏感度。
jdb电子平台作为IVD行业多年来的金牌服务商，除了提供免疫层析试纸条生产设备以外，同时也提供相关耗材。
当下Covid-19仍处于紧张焦灼的态势，国家药监局已批准31个Covid-19抗原检测试剂盒生产厂家。抗原检测更为直接，操作简单且速度快。作为核酸检测的辅助和补充，能进一步提高“早发现”能力，提高监测预警灵敏度，为疫情防控提供技术支撑。
众所周知，NC膜广泛应用于制作免疫层析诊断试纸条，其需求的紧张情况随着抗原检测需求的不断增加依然会持续一段时间，在NC膜一卷难求的局面下，jdb电子平台作为印度SR Biocra NC膜在国内的独家进口代理商，力求为客户提供合适原材料、全面的生产整体解决方案，助力客户提高产率，提升产品品质。
jdb电子平台NC膜产品一览
样 品
常规：300*20mm/kit（5pcs）
300*25mm/kit（5pcs）
大货规格：100*20mm
100*25mm
产品参数
A. 物理测试数据
聚酯背衬厚度(μm）：105
膜厚度(μm）：110
膜涨破强度(psi）：45
膜颜色：纯白
B. 功能测试
毛细作用速率 （s/4cm）：85
蛋白结合度 （μg/c㎡）：48
(牛血清蛋白，pH=7.4）
切条效果：无膜边缘损坏
C. 尺寸测试
膜宽度（mm）：25或20
储存条件：温度15-28 ℃
保质期：一年
产能
500卷/天
供货周期1000卷，预计2-3周
注意：膜应该保存在原铝箔包装内并储存在凉爽、干燥的地方，尽量避开阳关直射和热辐射。
除了以上的免疫诊断试纸耗材，jdb电子平台还提供Covid-19检测产品全系列生产设备，我们已为国内外众多知名IVD生产商提供检测试剂盒生产设备和耗材。
如果您有相关检测试剂盒生产需求，可与我们联系，我们将不余遗力的为您提供符合您的设备或耗材，持续为疫情防控提供技术及生产支撑，与时间赛跑、与病毒博弈！共同助力防控工作！
欢迎随时与我们联系！您可以致电021-38015501或朱经理：17301628785。
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